Аннотация

Во многих органах и тканях человека наблюдается микрохимеризм, приобретенный естественным образом. Однако, до сих пор не было исследований, посвященных фетальному микрохимеризму в головном мозге. Недавно были сообщения о фетальном и материнском микрохимеризме в головном мозге мышей. В данном исследовании мы провели количественный анализ мужской ДНК в женском головном мозге в качестве маркера фетального микрохимеризма (в частности, приобретения женщиной мужской ДНК после рождения ребенка мужского пола). Выбрав в качестве объекта анализа ген DYS14, специфичный для Y-хромосомы, мы проводили количественную ПЦР в реальном времени аутопсированного мозга женщин без клинических и патологоанатомических признаков неврологической патологии (n = 26), а также женщин, страдающих болезнью Альцгеймера (n = 33). У 63% женщин (37 из 59) был выявлен мужской скрытый микрохимеризм в нескольких областях головного мозга. Результаты анализа показали более низкую распространенность (p = 0,03) и концентрацию (p = 0,06) мужского микрохимеризма в мозге женщин с болезнью Альцгеймера, по сравнению с женщинами, не страдавшими неврологической патологией. Наконец, мы пришли к заключению о том, что у человека мужской микрохимеризм в женском головном мозге широко распространен.

Введение

Во время беременности организм женщины и плода обмениваются клетками и генетическим материалом [1], после чего в организме реципиента могут сохраняться чужеродные клетки и/или ДНК [2], [3]. Такой приобретенный естественным путем микрохимеризм (МХ) способен оказывать положительное или негативное влияние на здоровье человека. Имеется связь между фетальным МХ (миграцией клеток фетального происхождения в организм матери, где они сохраняются в течение десятилетий) и несколькими различными аутоиммунными заболеваниями, а также процессами репарации тканей и иммунодефицитными состояниями [4]–[6].

МХ представлен в разных органах человека, в различном количестве и с разной степенью распространенности [7]–[13], однако, неизвестно, присутствует ли он в головном мозге, и если присутствует, то с какой частотой. Недавно был описан фетальный МХ в головном мозге мышей [14], [15]. В ограниченных исследованиях был описан материнский МХ в головном мозге плода человека [9].

В данном исследовании нами была выполнена количественная ПЦР (qPCR) в реальном времени с целью обнаружения и количественной оценки мужской ДНК в нескольких областях головного мозга женщин, в качестве маркера выбрана последовательность гена DYS14, специфичного для Y-хромосомы. У умерших женщин, от которых были взяты образцы ткани, не было клинических и патологоанатомических признаков неврологических заболеваний. Также мы проанализировали образцы головного мозга, полученные от женщин, страдавших болезнью Альцгеймера (БА). Это связано с тем, что была замечена более высокая распространенность БА среди рожавших женщин по сравнению с нерожавшими [16], [17]. Большее количество беременностей коррелирует с более высоким риском БА и ее началом в более раннем возрасте [17], [18].

Методы

Предмет и материалы

Данное исследование было одобрено надзорным советом Центра Исследований Рака Фреда Хатчинсона (номер 5369, протокол 1707). Субъектами исследования были умершие женщины, не страдавшие неврологическими заболеваниями, а также страдавшие БА, в общей сложности 59 умерших женщин. У 26 женщин не было неврологической патологии. Тридцать три женщины страдали БА (таблица 1). Аутопсийные образцы мозга данных женщин поступили к нам из двух учреждений: отделения патологии в Вашингтонском университете в Сиэтле, Вашингтон, и из Гарвардского ресурсного центра ткани головного мозга, учрежденного в больнице Маклин в Белмонте, штат Массачусетс. Образцы из Вашингтонского университета были взяты от взрослых женщин, у которых в анамнезе в течение двух лет перед смертью не было неврологической патологии, и не выявлено признаков заболеваний в ходе гистологического исследования ткани головного мозга, а также от женщин, у которых в течение жизни была диагностирована вероятная БА[19], а также встречались нейропатологические (National Institute on Aging-Reagan Institute consensus) критерии диагностики БА. Аналогично были получены образцы из Гарвардского ресурсного центра ткани головного мозга, от женщин, которые не страдали неврологическими заболеваниями, а также от женщин, которые соответствовали клиническим и патологическим критериям диагностики БА. Все женщины умерли в возрасте от 32 до 101 года (таблица 1). Возраст женщин, в котором была диагностирована БА, известен для образцов, поступивших из Вашингтонского университета (медиана: 77 лет, диапазон: 64-93 года). После вскрытия образцы головного мозга были фиксированы формалином, либо заморожены в жидком азоте. В зависимости от доступности, у каждой женщины были получены образцы тканей из 2–12 разных областей головного мозга. Исследуемые области головного мозга включали: лобные, теменные, височные, затылочные доли, поясную извилину, гиппокамп, миндалевидное тело, хвостатое ядро, скорлупу (путамен), бледный шар, таламус, продолговатый мозг, мост, мозжечок и спинной мозг. На каждую женщину, страдавшую БА, было в среднем получено больше образцов ткани по сравнению с женщинами, у которых не было неврологических заболеваний, но данная разница не была статистически значимой (3,6 против 2,5, соответственно, р = 0,05). Суммарно среди всех субъектов, чьи ткани были получены из двух учреждений, женщины, страдавшие БА, на момент смерти были значительно старше (р <0,001), существенных различий во времени, прошедшем с момента смерти, не было (p = 0,06, таблица 1). Наиболее вероятным источником мужского МХ в головном мозге женщин является приобретение женщиной мужской ДНК во время беременности плодом мужского пола. Был доступен ограниченный акушерский анамнез, у большинства женщин он был неизвестен. Известно, что у девяти из них был, как минимум, один сын: у восьми больных БА и у одной не страдавшей неврологическими заболеваниями. Также известно, что у двух женщин нет сыновей: у одной страдавшей БА и у одной не имевшей неврологических заболеваний.

Таблица 1

Характеристики женщин без неврологических заболеваний и женщин, страдавших болезнью Альцгеймера.

Таблица 1

Извлечение ДНК

Геномная ДНК была получена из ткани головного мозга с использованием набора QIAamp® DNA Mini Kit (QIAGEN, Valencia, CA) в соответствии с протоколом производителя.

qPCR в реальном времени

Мужскую ДНК в ткани женского головного мозга определяли путем амплификации специфичной для Y-хромосомы последовательности DYS14 (GenBank Accession X06325) [21] с применением анализа TaqMan® и ABI Prism® 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Праймерные и зондовые последовательности для количественного определения DYS14 [22], а также подготовка стандартных кривых, состава смеси для qPCR и тепловой профиль [23] были описаны ранее. Квадрат коэффициента корреляции для всех стандартных кривых всегда составлял более 0,99. Ни один эксперимент не включал шаблонов для проверки на контаминацию мужской ДНК во время установки пластины, все контроли были отрицательными. Для каждого образца было проанализировано минимум шесть лунок. Среднее значение Ct составляло 36, с диапазоном от 30 до 39 для всех образцов, кроме B6388, который находился в диапазоне между 26 и 29. Репрезентативная диаграмма амплификации представлена на рис. S1. Для расчета концентрации МХ использовались только лунки, в которых амплификация происходила при Ct <40. В отдельной лунке количество ДНК, подверженное qPCR, не превышало эквивалента 3,5 × 104 генома (один геном приблизительно равен 6,6 пг ДНК), так как это могло бы ингибировать амплификацию. Среднее количество ДНК в каждой тестируемой лунке было определено путем одновременной амплификации последовательности бета-глобина в отдельных дублированных лунках (праймерные и зондовые последовательности, описанные ранее [24], за исключением того, что репортер FAM был заменен VIC). Конечная концентрация мужских МХ была выражена в виде количества мужских геномных эквивалентов (gEq) ДНК, которые были бы обнаружены в образце, содержащем эквивалент 1 × 105 полных геномов (gEq/105). Общие протестированные gEq на образец не отличались между двумя группами (медианы: 1,3×105 против 1,5×105, p=0,50). Поскольку DYS14 представляет собой мультикопии гена [21], и наш анализ qPCR обладает высокой чувствительностью, а также из-за возможности перекрестной контаминации образцов мужской ДНК неизвестного происхождения до извлечения ДНК (т. е. в процессе получения и обработки образцов), либо из установки qPCR , мы трактовали результат как положительный более консервативно, применяя дополнительные критерии: 1) амплификация произошла, по меньшей мере, в двух лунках в течение одного эксперимента; 2) общая концентрация мужского МХ составляла более 0,5 gEq/ 105. Таким образом, оценки мужского МХ могут быть ниже истинных значений. С другой стороны, поскольку обнаружение мужской ДНК не учитывало наличие МХ, потенциально внесенного женскими плодами, это могло привести к недооценке общего количества МХ в головном мозге. HLA-специфическая qPCR, как сообщалось ранее [25], [26], является другим подходом к обнаружению МХ, который не зависит от пола. Такой анализ требует участия членов семьи, что было невозможно в текущих исследованиях. В качестве дополнительного исследования мы тестировали аутопсированный головной мозг женщины, страдавшей системным склерозом с помощью HLA-специфической qPCR, для которой у нас имелся семейный генотип HLA. Объектом анализа был HLA ребенка, передаваемый по отцовской линии, как описано ранее [26], [27]. Данные приведены в таблицах S1 и S2. Все данные qPCR были проанализированы с использованием программного обеспечения System Sequence Detection Software.

Статистика

Субъекты и характеристики измерения МХ сравнивались по группам с помощью критерия хи-квадрат для категорических данных и t-критерия для непрерывных данных. Распространенность и концентрация МХ проанализированы в зависимости от статуса женщин (больна/здорова). Модель логистической регрессии использовалась для оценки взаимосвязи между распространенностью МХ и статусом женщин, с поправкой на общий протестированный gEq, возраст смерти и время с момента смерти. Оценки также были скорректированы с учетом возможной корреляции между повторными измерениями у одного и того же субъекта с помощью обобщенных оценочных уравнений. Ассоциация была заявлена как отношение шансов (OR, odds ratio) вместе со значением p для указания значимости. Например, OR 0,30 можно интерпретировать так: шансы иметь БА для субъекта, который показал положительный результат на МХ, были на 70% ниже, чем для испытуемого, который показал отрицательный результат. Также мы анализировали концентрации МХ как результат в моделях логарифмической линейной регрессии Пуассона, предполагая, что количество gEq, обнаруженное как МХ, было прямо пропорционально количеству всех тестируемых gEq. Согласно определению, МХ встречается редко, поэтому распределение данных смещается вправо. Мы использовали отрицательное биномиальное распределение для учета высокой степени сверхдисперсии данных; интерпретация полученных оценок идентична интерпретации модели Пуассона. Корректировки потенциальных помех и возможной корреляции между повторными измерениями были выполнены, как описано выше. Отношение уровней частоты (rate ratio, RR), а также значение p для указания значимости использовались для сравнения наблюдаемых уровней обнаружения МХ в двух группах. Например, RR 0,30 можно было бы интерпретировать так: уровни обнаружения МХ у субъектов с БА на 70% ниже, чем у субъектов без неврологических заболеваний. Был проведен дополнительный анализ для определения того, был ли статус заболевания ассоциирован с распространенностью или концентрацией МХ в подгруппе образцов из областей мозга, которые, как считается, наиболее подвержены воздействию БА. Кроме того, мы исследовали, коррелировала ли распространенность или концентрация МХ со стадией Braak, которая описывает степень распространения нейрофибриллярных клубков у субъектов с БА [28] или с HLA-DRB1*1501, аллелем антигена лейкоцитов человека, который ассоциирован с БА [29]. Двусторонние значения р из регрессионных моделей были получены из теста Вальда. Анализы проводились на программном обеспечении SAS версии 9 (SAS Institute, Inc., Cary, NC).

Результаты

Распространенность и концентрация МХ в областях мозга

Медиана протестированных образцов на одного субъекта составила 3, с диапазоном от 1 до 12. В таблице 2 представлены данные о распространенности уровня мужского МХ в зависимости от области мозга для всех субъектов. Было проанализировано от 2 до 35 образцов каждой области мозга на наличие мужской ДНК. Хотя было мало образцов, мы не обнаружили мужскую ДНК в лобной доле и скорлупе. Самая высокая распространенность была обнаружена в продолговатом мозге. У всех субъектов концентрации МХ составили от 0-512,5 гEq/105, со средним значением 0,2, 90-й процентиль – 3,7 гEq/105 (рисунок 1). Один из субъектов, не имевший неврологического заболевания (код B6388, возраст смерти 69 лет), образцы которого были получены из Гарвардского ресурсного центра ткани головного мозга, имел три образца с наивысшими значениями концентрации в нашем наборе данных (296,1, 481,8 и 512,5 gEq/105 в височной доле, поясной извилине и мосте соответственно). Применив флуоресцентную гибридизацию in situ, мы обнаружили редкие мужские клетки в головном мозге B6388 (рис. S2). Остальные значения концентраций в наборе данных составили 29,4 гEq/105 или менее. Что касается взаимосвязи между акушерским анамнезом и распространенностью МХ, у пяти из девяти испытуемых, которые, как известно, имели по крайней мере одного сына, были обнаружены мужские МХ по крайней мере в одной из областей мозга (таблица S3). У всех женщин с положительным результатом была БА; среди субъектов с отрицательным результатом были три с БА и один без неврологических заболеваний. Одна из двух женщин, у которых не было сыновей (не имевшая неврологических заболеваний), также оказалась положительна на МХ, вторая женщина с отрицательным результатом на МХ имела БА.

Распространенность и концентрация мужских МХ в мозге человека: женщины без неврологических заболеваний и женщины с БА

Из 183 образцов 64 (35%) имели положительный результат на МХ (таблица 2). Восемнадцать из 26 женщин без неврологической патологии (69%) имели по крайней мере по одному положительному значению, всего 30 положительных результатов в 65 образцах (46%). Девятнадцать из 33 женщин с БА (58%) имели по крайней мере по одному положительному значению, всего 34 положительных результата в 118 образцах (29%). Оценочный OR одномерной модели составлял 0,47 (95% доверительный интервал (ДИ) 0,21–1,08, p=0,08). После корректировки в соответствии с общим протестированным gEq, датой смерти и временем, прошедшим с момента смерти, была выявлена взаимосвязь между БА и более низкой распространенностью МХ: OR 0.40 (95% ДИ 0.17–0.93, p = 0.03). Таким образом, шансы иметь БА для субъектов, которые показали положительный результат на МХ, были на 60% ниже, чем для испытуемых, которые показали отрицательный результат. Когда были проанализированы концентрации МХ в зависимости от наличия БА или отсутствия неврологической патологии, оценка RR по скорректированной модели составила 0,05 (95% ДИ 0,01-0,39, p=0,004). Однако, после исключения образцов головного мозга субъекта B6388, у которого не было неврологического заболевания, и уровень мужского МХ был в 10 раз больше, чем следующая самая высокая концентрация у другого субъекта, результаты резко изменились: 0,41 RR (95% ДИ 0.16-1.05, p=0,06). Таким образом, частота обнаружения МХ у субъектов с БА была на 59% ниже, чем у субъектов без неврологических заболеваний, но не была статистически значимой. Возраст смерти также не был статистически значимо связан с распространенностью МХ, как в одномерных, так и в скорректированных моделях (корректировка в соответствии со статусом женщины (больна БА/без неврологической  патологии) и общим протестированным gEq, p=0,79). Тем не менее, какая-либо взаимосвязь между возрастом смерти и мужским МХ от предшествующих беременностей мужским плодом не может быть оценена, так как акушерский анамнез и временной интервал от беременности до смерти были неизвестны для женщин, чьи образцы тканей были проанализированы.

Микрохимеризм

Рисунок 1 Концентрация мужского МХ в областях головного мозга у женщин.

Микрохимеризм женский головной мозг

Таблица 2
Распространенность мужского МХ в отдельных областях мозга у женщин без неврологических заболеваний и у женщин, страдавших болезнью Альцгеймера.

Распространенность и концентрация мужского МХ в областях мозга, пораженных БА

Мы провели вторичный анализ образцов, полученных из пяти областей мозга, которые, как считается, наиболее подвержены поражению при БА: миндалины, гиппокампа, лобной, теменной и височной доли [30], [31]. Учитывая только эти регионы, 12 из 24 женщин без неврологического заболевания (50%) имели по крайней мере одно положительное значение, 12 положительных результатов в 24 образцах (50%). Тринадцать из 33 женщин с БА (39%) имели по крайней мере одно положительное значение, всего 15 положительных результатов в 44 образцах (34%). Скорректированный OR, описывающий связь между распространенностью МХ и статусом женщины (больна БА/без неврологической патологии), составил 0,48 (95% ДИ 0,14–1,62, p=0,23). Таким образом, шансы иметь БА для субъекта, который показал положительный результат на МХ в областях мозга, наиболее подверженных поражению при данном заболевании, на 52% ниже, чем для субъекта, который показал отрицательный результат, но это не является статистически значимым. Однако ни у одного из субъектов без неврологического заболевания не было получено образцов ткани из миндалины или лобной доли. При сравнении концентрации МХ в группах, исключая один экземпляр у субъекта B6388, скорректированный RR составил 0,27 (95% ДИ 0,13–0,56, p <0,001). Таким образом, соотношение положительных результатов не имело существенных различий между группами, но концентрации МХ в этом подмножестве образцов головного мозга у субъектов с БА имели тенденцию принимать более низкие значения, чем те, которые были обнаружены у субъектов без неврологического заболевания. В ходе других анализов не было обнаружено достоверной связи между распространенностью или концентрацией МХ и стадией Braak (табл. 1, p=0,99 и 0,93 соответственно), а также никакой значимой связи между распространенностью МХ и HLA-DRB1*1501 (8 из 11 носителей DR15, позитивных на МХ (73%) против 16 из 31 испытуемых без DR15, позитивных на МХ (52%), p = 0,13).

Обсуждение

В данном исследовании мы впервые описали мужской МХ в женском мозге и в его отдельных областях у человека. В совокупности с данными, показывающими наличие мужской ДНК в спинномозговой жидкости [32], полученные нами результаты показывают, что эмбриональная ДНК и, вероятно, клетки могут пересекать гематоэнцефалический барьер человека (ГЭБ) и находиться в головном мозге. Во время беременности в ГЭБ возникают изменения [33], поэтому создается уникальная возможность для появления МХ в головном мозге. Также уникальным для нашего исследования является вывод о том, что мужской МХ в головном мозге человека встречается относительно часто (положительные результаты у 63% испытуемых), распределен в нескольких областях мозга и потенциально сохраняется на протяжении всей жизни человека (самая старая женщина, у которой была обнаружена мужская ДНК, умерла в возрасте 94 года). Способность МХ проникать через ГЭБ и находиться в головном мозге была впервые показана в исследованиях на мышах, которые продемонстрировали присутствие чужеродных клеток и ДНК в мозге мышей [14], [15]. Однако распространенность МХ в головном мозге у мышей не была четко определена, так как частота варьируется в зависимости от исследования [14], [15], [34]–[36], в одном из них МХ вообще не наблюдался [37]. Подобно данным, полученным во время исследований на мышах, наше исследование на людях показало, что МХ присутствовал в головном мозге не у всех испытуемых. Даже у тех, кто показал позитивный результат, МХ присутствовал не во всех областях головного мозга. Концентрация МХ также подвержена существенной изменчивости. В целом наши данные дополняют и расширяют другие работы, описывающие МХ в общей человеческой популяции, в периферической крови и на уровне ткани/органа, изучаемого у одного субъекта и между субъектами [9]–[13]. В настоящее время невозможно достоверно сравнить распространенность и концентрацию МХ в мозге и других тканях человека, так как нам не были доступны другие ткани наших испытуемых. Кроме того, в предшествующих исследованиях, в которых проводилась оценка МХ в других органах, не всегда использовались количественные методы.

Наиболее вероятным источником мужского МХ в женском мозге является приобретение фетального МХ в результате беременности мужским плодом. Женщинами, не имеющими сыновей, мужская ДНК также может быть получена в результате аборта или выкидыша [22], [23], [38]–[40]. В текущем исследовании у всех женщин, кроме отдельных, не был известен акушерский анамнез, поэтому мужской МХ не мог быть оценен в совокупности с конкретным предшествующим акушерским анамнезом. Помимо предшествующих беременностей, источником мужского МХ у женщины может быть брат-близнец, в том числе при синдроме исчезающего близнеца [41]–[43], а также старший брат или случаи переливания крови [44].

Так как БА более распространена у женщин, чем мужчин, и повышенный риск отмечается у рожавших по сравнению с нерожавшими, а также имеется корреляция с более ранним началом заболевания [16]–[18], мы также проанализировали на мужской МХ женщин, страдавших БА. БА является нейродегенеративным заболеванием, характеризующимся повышенным уровнем амилоидных бляшек, цереброваскулярного амилоидоза и нейрофибриллярных клубочков [30]. Мы получили неожиданные результаты, согласно которым, женщины с БА имеют более низкую распространенность мужского МХ в головном мозге и более низкие концентрации мужского МХ в областях мозга, которые наиболее подвержены поражению при БА. Однако количество испытуемых было небольшим, и, как указывалось ранее, акушерский анамнез в значительной степени был неизвестен. Объяснение низкого уровня МХ при БА, если это наблюдение будет воспроизведено в более крупном исследовании, не будет очевидным. При других заболеваниях были описаны как благоприятные, так и негативные последствия фетального МХ у млекопитающих, в зависимости от нескольких факторов, включая специфический тип и источник МХ [6]. Существенным ограничением нашего исследования стала невозможность идентификации типа и источника мужского МХ, и дальнейшие исследования, которые смогут различить генетически нормальный и аномальный МХ, будут представлять потенциальный интерес.

В настоящее время биологическое значение скрытого МХ в мозге человека требует дальнейшего изучения. Вероятно, МХ способен десятилетиями персистировать в крови, костях и костном мозге [2], [45], и он присутствует в разных гемопоэтических линиях [46]. Более того, МХ, видимо, интегрирует и генерирует специфические типы клеток в тканях [10], [11], [47] — [49]. Во время исследования мышей фетальные МХ в материнском мозге напоминали периваскулярные макрофаги, нейроны, астроциты и олигодендроциты, как морфологически, так и фенотипически, и занимали соответствующие ниши [15], [36]. Таким образом, возможно, МХ в мозге способен дифференцироваться в различные зрелые фенотипы или претерпевает слияние с уже существующими клетками и приобретает новый фенотип, как было предложено в ходе исследования на мышах и людях, в котором клетки, полученные из костного мозга, проникали в головной мозг и давали начало нервным клеткам путем дифференцировки или сливались с уже существующими нейронами [50]–[53]. Наконец, в нескольких исследованиях сообщалось об ассоциации между способностью к деторождению и снижением риска развития рака мозга, это свидетельствует в пользу того, что МХ мог бы способствовать активации иммунной системы против опухолевых клеток, как это было предложено для некоторых других типов злокачественных новообразований [6], [54]–[56].

Наконец, можно заключить, что мужской МХ в женском головном мозге широко распространен у людей. Хотя взаимосвязь между МХ мозга и здоровьем/болезнью требует дальнейшего изучения, наши результаты показывают, что фетальный МХ может повлиять на здоровье матери и потенциально иметь эволюционное значение.

Вспомогательная информация

Рисунок S1

Амплификация участка DYS14 в типичном образце головного мозга. Показана амплификация участка в образце поясной извилины женщины с БА.

Рисунок S1

Рисунок S1

Рисунок S2

рисунок s2

Рисунок S2

Обнаружение мужских ядер в женском мозге путем флуоресцентной гибридизации in situ (Рис S2). Фиксированные формалином и помещенные в парафин образцы моста субъекта B6388, у которого мужской МХ был определен количественно в концентрации 512.5 gEq/105 при помощи qPCR, были гибридизованы с флуоресцентными зондами, специфичными для хромосом X и Y. Срезы тканей были депарафинизированы, регидратированы и денатурированы в растворе 44% муравьиной кислоты и 0,3% перекиси водорода в течение 15 минут, инкубированы в растворе для восстановления (retrieval – не совсем понял значение в данном контексте) антигенов (Dako, Carpinteria, CA) в обычной пароварке более 30 минут. Дальнейшая денатурация проводилась с использованием 0,2N соляной кислоты в течение 20 минут. Срез был промыт 2×хлоридом натрия/цитратом натрия (SSC), содержащим 0,05% Tween-20, инкубирован в 2×SSC при 42°C в течение 30 минут и обработан пепсином (DIGEST-ALL ™ 3, Dako) при 37°С в течение 10 минут. Срез был дегидратирован, высушен на воздухе, флуоресцентные зонды, специфичные для Х и Y-хромосом, разведены в гибридизационной смеси (10% декстрансульфата, 2×SSC и 50% формамида) и нанесены с помощью покровного стекла. X и Y-хромосомные зонды были описаны ранее (Lau et al., Lancet 1:14-16, Waye and Willard. Nucleic Acids Res 13:2731-2743) и были конъюгированы с Alexa Fluor 555 и 488 соответственно, используя FISH Tag ™ DNA Kit (Molecular Probes, Eugene, OR). Зонды были денатурированы при 90°С в течение 10 минут. Гибридизация проводилась в течение ночи в увлажненной камере при 37°С в течение 16 часов. После гибридизации срез был промыт в 2×SSC, затем дважды промыт в 2×SSC, содержащем 50% формамида, и окончательную промыт в 2×SSC. Все промывания после гибридизации проводились при 42°С в течение 5 минут. Срез был обработан 50 мМ буфером ацетата аммония (pH 5), содержащим 1 мМ сульфата меди в течение 30 минут, чтобы уменьшить аутофлуоресценцию, затем заключен в среде VECTASHIELD® Mounting Medium, содержащей 4′,6-диамидино-2-фенилиндол (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Для облегчения обнаружения редко встречаемых мужских ядер на фоне большого количества женских ядер срез был визуализирован путем автоматического сканирования с использованием системы TissueFAXS System (TissueGnostics USA, Tarzana, CA) в режиме флуоресценции с объективом 40×. Изображения всех ядер, которые одновременно подавали сигналы красного и зеленого цвета, были просмотрены вручную. Предполагаемые мужские ядра были повторно исследованы с использованием объектива 100× и масляной иммерсии, изображения были собраны с использованием опции Z-stack. Изображения были деконволюционированы с использованием программного обеспечения Volocity® 3D Image Analysis Software (PerkinElmer, Waltham, MA). Показан пример мужского ядра (обозначен стрелкой и белой рамкой) при финальном увеличении 400×. Было подтверждено, что сигналы гибридизации являются ядерными, после деконволюции с помощью Z-stack изображения содержат предполагаемое мужское ядро (не показано).

Таблица S1

HLA-генотипирование семьи для исследования фетального микрохимеризма в мозге матери.

Click here for additional data file

Таблица S2

Количественная оценка фетального микрохимеризма в мозге матери с помощью HLA-специфической qPCR.

Click here for additional data file.

Таблица S3

Распространенность и концентрация МХ среди женщин, которые, как известно, имеют по крайней мере одного сына.

Click here for additional data file.

Благодарности

Мы признательны Центру Изучения Болезни Альцгеймера в Вашингтонском университете (P50 AG05136) и Гарвардскому ресурсному центру ткани головного мозга (R-24-MH 068855) за предоставление образцов тканей из определенных областей головного мозга. Мы благодарим Aimee Schantz из Центра Изучения Болезни Альцгеймера, George Tejada и доктора John Hedreen из Гарвардского ресурсного центра ткани головного мозга, Dawn Stief, Samantha Bel и Experimental Histopathology Shared Resource в Центре Исследований Рака Фреда Хатчинсона за их помощь.

Заявление о финансировании

Данная работа была поддержана National Institutes of Health (NS 071418 и AI-41721 — JLN). WFNC была поддержана Canadian Institutes of Health Research Fellowship Award (SIB-95173). Финансирующие организации не принимали какого-либо участия в разработке исследования, сборе и анализе данных, решении о подготовке и публикации статьи.

ИСТОЧНИК:  PLoS One. 2012; 7(9): e45592.  Published online 2012 Sep 26. doi:  10.1371/journal.pone.0045592.  ПЕРЕВОД: uronews.ru Матюхов Игорь Павлович

Ссылки

1. Lo YM, Lau TK, Chan LY, Leung TN, Chang AM (2000) Quantitative analysis of the bidirectional fetomaternal transfer of nucleated cells and plasma DNA. Clin Chem 46: 1301–1309 [PubMed]

2. Bianchi DW, Zickwolf GK, Weil GJ, Sylvester S, DeMaria MA (1996) Male fetal progenitor cells persist in maternal blood for as long as 27 years postpartum. Proc Natl Acad Sci U S A 93: 705–708 [PMC free article] [PubMed]

3. Maloney S, Smith A, Furst DE, Myerson D, Rupert K, et al. (1999) Microchimerism of maternal origin persists into adult life. J Clin Invest 104: 41–47 [PMC free article] [PubMed]

4. Fugazzola L, Cirello V, Beck-Peccoz P (2011) Fetal microchimerism as an explanation of disease. Nat Rev Endocrinol 7: 89–97 [PubMed]

5. Gammill HS, Nelson JL (2010) Naturally acquired microchimerism. Int J Dev Biol 54: 531–543 [PMC free article] [PubMed]

6. Nelson JL (2012) The otherness of self: microchimerism in health and disease. Trends Immunol 33: 421–427 [PMC free article] [PubMed]

7. Jonsson AM, Papadogiannakis N, Granath A, Haggstrom J, Schaffer M, et al. (2010) Maternal microchimerism in juvenile tonsils and adenoids. Pediatr Res 68: 199–204 [PubMed]

8. Gotherstrom C, Johnsson AM, Mattsson J, Papadogiannakis N, Westgren M (2005) Identification of maternal hematopoietic cells in a 2nd-trimester fetus. Fetal Diagn Ther 20: 355–358 [PubMed]

9. Jonsson AM, Uzunel M, Gotherstrom C, Papadogiannakis N, Westgren M (2008) Maternal microchimerism in human fetal tissues. Am J Obstet Gynecol 198: 325 e321–326. [PubMed]

10. Stevens AM, Hermes HM, Kiefer MM, Rutledge JC, Nelson JL (2009) Chimeric maternal cells with tissue-specific antigen expression and morphology are common in infant tissues. Pediatr Dev Pathol 12: 337–346 [PMC free article] [PubMed]

11. Khosrotehrani K, Johnson KL, Cha DH, Salomon RN, Bianchi DW (2004) Transfer of fetal cells with multilineage potential to maternal tissue. Jama 292: 75–80 [PubMed]

12. Koopmans M, Kremer Hovinga IC, Baelde HJ, Fernandes RJ, de Heer E, et al. (2005) Chimerism in kidneys, livers and hearts of normal women: implications for transplantation studies. Am J Transplant 5: 1495–1502 [PubMed]

13. Koopmans M, Kremer Hovinga IC, Baelde HJ, Harvey MS, de Heer E, et al. (2008) Chimerism occurs in thyroid, lung, skin and lymph nodes of women with sons. J Reprod Immunol 78: 68–75 [PubMed]

14. Kaplan J, Land S (2005) Influence of maternal-fetal histocompatibility and MHC zygosity on maternal microchimerism. J Immunol 174: 7123–7128 [PubMed]

15. Tan XW, Liao H, Sun L, Okabe M, Xiao ZC, et al. (2005) Fetal microchimerism in the maternal mouse brain: a novel population of fetal progenitor or stem cells able to cross the blood-brain barrier? Stem Cells 23: 1443–1452 [PubMed]

16. Ptok U, Barkow K, Heun R (2002) Fertility and number of children in patients with Alzheimer’s disease. Arch Womens Ment Health 5: 83–86 [PubMed]

17. Colucci M, Cammarata S, Assini A, Croce R, Clerici F, et al. (2006) The number of pregnancies is a risk factor for Alzheimer’s disease. Eur J Neurol 13: 1374–1377 [PubMed]

18. Sobow TM, Kloszewska I (2003) Modulation of age at onset in late-onset sporadic Alzheimer’s disease by estrogen-related factors: the age of menopause and number of pregnancies. Ger J Psychiatry 6: 49–55

19. Gearing M, Mirra SS, Hedreen JC, Sumi SM, Hansen LA, et al. (1995) The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer’s Disease (CERAD). Part X. Neuropathology confirmation of the clinical diagnosis of Alzheimer’s disease. Neurology 45: 461–466 [PubMed]

20. Aging NIo (1997) Consensus recommendations for the postmortem diagnosis of Alzheimer’s disease. The National Institute on Aging, and Reagan Institute Working Group on Diagnostic Criteria for the Neuropathological Assessment of Alzheimer’s Disease. Neurobiol Aging 18: S1–2 [PubMed]

21. Arnemann J, Epplen JT, Cooke HJ, Sauermann U, Engel W, et al. (1987) A human Y-chromosomal DNA sequence expressed in testicular tissue. Nucleic Acids Res 15: 8713–8724 [PMC free article] [PubMed]

22. Lambert NC, Lo YM, Erickson TD, Tylee TS, Guthrie KA, et al. (2002) Male microchimerism in healthy women and women with scleroderma: cells or circulating DNA? A quantitative answer. Blood 100: 2845–2851 [PubMed]

23. Yan Z, Lambert NC, Guthrie KA, Porter AJ, Loubiere LS, et al. (2005) Male microchimerism in women without sons: quantitative assessment and correlation with pregnancy history. Am J Med 118: 899–906 [PubMed]

24. Lo YM, Tein MS, Lau TK, Haines CJ, Leung TN, et al. (1998) Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis. Am J Hum Genet 62: 768–775 [PMC free article] [PubMed]

25. Gammill HS, Adams Waldorf KM, Aydelotte TM, Lucas J, Leisenring WM, et al. (2011) Pregnancy, microchimerism, and the maternal grandmother. PLoS One 6: e24101. [PMC free article] [PubMed]

26. Lambert NC, Erickson TD, Yan Z, Pang JM, Guthrie KA, et al. (2004) Quantification of maternal microchimerism by HLA-specific real-time polymerase chain reaction: studies of healthy women and women with scleroderma. Arthritis Rheum 50: 906–914 [PubMed]

27. Chan WF, Atkins CJ, Naysmith D, van der Westhuizen N, Woo J, et al. (2012) Microchimerism in the rheumatoid nodules of patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 64: 380–388 [PMC free article] [PubMed]

28. Braak H, Braak E (1991) Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol 82: 239–259 [PubMed]

29. Zota V, Nemirovsky A, Baron R, Fisher Y, Selkoe DJ, et al. (2009) HLA-DR alleles in amyloid beta-peptide autoimmunity: a highly immunogenic role for the DRB1*1501 allele. J Immunol 183: 3522–3530 [PubMed]

30. Blennow K, de Leon MJ, Zetterberg H (2006) Alzheimer’s disease. Lancet 368: 387–403 [PubMed]

31. Wenk GL (2003) Neuropathologic changes in Alzheimer’s disease. J Clin Psychiatry 64 Suppl 97–10 [PubMed]

32. Angert RM, Leshane ES, Yarnell RW, Johnson KL, Bianchi DW (2004) Cell-free fetal DNA in the cerebrospinal fluid of women during the peripartum period. Am J Obstet Gynecol 190: 1087–1090 [PubMed]

33. Cipolla MJ, Sweet JG, Chan SL (2011) Cerebral vascular adaptation to pregnancy and its role in the neurological complications of eclampsia. J Appl Physiol 110: 329–339 [PMC free article] [PubMed]

34. Fujiki Y, Johnson KL, Peter I, Tighiouart H, Bianchi DW (2009) Fetal cells in the pregnant mouse are diverse and express a variety of progenitor and differentiated cell markers. Biol Reprod 81: 26–32 [PMC free article] [PubMed]

35. Khosrotehrani K, Johnson KL, Guegan S, Stroh H, Bianchi DW (2005) Natural history of fetal cell microchimerism during and following murine pregnancy. J Reprod Immunol 66: 1–12 [PubMed]

36. Zeng XX, Tan KH, Yeo A, Sasajala P, Tan X, et al. (2010) Pregnancy-associated progenitor cells differentiate and mature into neurons in the maternal brain. Stem Cells Dev 19: 1819–1830 [PubMed]

37. Fujiki Y, Johnson KL, Tighiouart H, Peter I, Bianchi DW (2008) Fetomaternal trafficking in the mouse increases as delivery approaches and is highest in the maternal lung. Biol Reprod 79: 841–848 [PMC free article] [PubMed]

38. Bianchi DW, Farina A, Weber W, Delli-Bovi LC, Deriso M, et al. (2001) Significant fetal-maternal hemorrhage after termination of pregnancy: implications for development of fetal cell microchimerism. Am J Obstet Gynecol 184: 703–706 [PubMed]

39. Lambert NC, Pang JM, Yan Z, Erickson TD, Stevens AM, et al. (2005) Male microchimerism in women with systemic sclerosis and healthy women who have never given birth to a son. Ann Rheum Dis 64: 845–848 [PMC free article] [PubMed]

40. Sato T, Fujimori K, Sato A, Ohto H (2008) Microchimerism after induced or spontaneous abortion. Obstet Gynecol 112: 593–597 [PubMed]

41. de Bellefon LM, Heiman P, Kanaan SB, Azzouz DF, Rak JM, et al. (2010) Cells from a vanished twin as a source of microchimerism 40 years later. Chimerism 1: 56–60 [PMC free article] [PubMed]

42. Stevens AM, Hermes HM, Lambert NC, Nelson JL, Meroni PL, et al. (2005) Maternal and sibling microchimerism in twins and triplets discordant for neonatal lupus syndrome-congenital heart block. Rheumatology (Oxford) 44: 187–191 [PubMed]

43. De Moor G, De Bock G, Noens L, De Bie S (1988) A new case of human chimerism detected after pregnancy: 46,XY karyotype in the lymphocytes of a woman. Acta Clin Belg 43: 231–235 [PubMed]

44. Lee TH, Paglieroni T, Ohto H, Holland PV, Busch MP (1999) Survival of donor leukocyte subpopulations in immunocompetent transfusion recipients: frequent long-term microchimerism in severe trauma patients. Blood 93: 3127–3139 [PubMed]

45. O’Donoghue K, Chan J, de la Fuente J, Kennea N, Sandison A, et al. (2004) Microchimerism in female bone marrow and bone decades after fetal mesenchymal stem-cell trafficking in pregnancy. Lancet 364: 179–182 [PubMed]

46. Evans PC, Lambert N, Maloney S, Furst DE, Moore JM, et al. (1999) Long-term fetal microchimerism in peripheral blood mononuclear cell subsets in healthy women and women with scleroderma. Blood 93: 2033–2037 [PubMed]

47. Bayes-Genis A, Bellosillo B, de la Calle O, Salido M, Roura S, et al. (2005) Identification of male cardiomyocytes of extracardiac origin in the hearts of women with male progeny: male fetal cell microchimerism of the heart. J Heart Lung Transplant 24: 2179–2183 [PubMed]

48. Nelson JL, Gillespie KM, Lambert NC, Stevens AM, Loubiere LS, et al. (2007) Maternal microchimerism in peripheral blood in type 1 diabetes and pancreatic islet beta cell microchimerism. Proc Natl Acad Sci U S A 104: 1637–1642 [PMC free article] [PubMed]

49. Stevens AM, McDonnell WM, Mullarkey ME, Pang JM, Leisenring W, et al. (2004) Liver biopsies from human females contain male hepatocytes in the absence of transplantation. Lab Invest 84: 1603–1609 [PubMed]

50. Cogle CR, Yachnis AT, Laywell ED, Zander DS, Wingard JR, et al. (2004) Bone marrow transdifferentiation in brain after transplantation: a retrospective study. Lancet 363: 1432–1437 [PubMed]

51. Johansson CB, Youssef S, Koleckar K, Holbrook C, Doyonnas R, et al. (2008) Extensive fusion of haematopoietic cells with Purkinje neurons in response to chronic inflammation. Nat Cell Biol 10: 575–583 [PMC free article] [PubMed]

52. Weimann JM, Charlton CA, Brazelton TR, Hackman RC, Blau HM (2003) Contribution of transplanted bone marrow cells to Purkinje neurons in human adult brains. Proc Natl Acad Sci U S A 100: 2088–2093 [PMC free article] [PubMed]

53. Weimann JM, Johansson CB, Trejo A, Blau HM (2003) Stable reprogrammed heterokaryons form spontaneously in Purkinje neurons after bone marrow transplant. Nat Cell Biol 5: 959–966 [PubMed]

54. Cantor KP, Lynch CF, Johnson D (1993) Reproductive factors and risk of brain, colon, and other malignancies in Iowa (United States). Cancer Causes Control 4: 505–511 [PubMed]

55. Hatch EE, Linet MS, Zhang J, Fine HA, Shapiro WR, et al. (2005) Reproductive and hormonal factors and risk of brain tumors in adult females. Int J Cancer 114: 797–805 [PubMed]

56. Lambe M, Coogan P, Baron J (1997) Reproductive factors and the risk of brain tumors: a population-based study in Sweden. Int J Cancer 72: 389–393 [PubMed]

Ответ

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

*

 

Этот сайт использует Akismet для борьбы со спамом. Узнайте как обрабатываются ваши данные комментариев.