В настоящее время нарушениям отцовского генома уделяется все большее внимание в репродуктивной медицине. Использование классического анализа спермы не всегда позволяет выявить отцовский эффект, обусловливающий нарушения эмбрионального развития [1, 2]. Отцовский эффект может быть связан с такими генетическими факторами, как генные мутации, микроделеции, анеуплоидии, повреждения ДНК и нарушения компактизации хроматина [3-5]. Сперматогенез — это сложный многостадийный процесс развития и созревания сперматозоидов из незрелых половых клеток. В среднем, продолжительность созревания сперматозоида занимает около двух с половиной месяцев. Нормальное протекание сперматогенеза требует скоординированного влияния многочисленных факторов (генетических, клеточных, гормональных и других). Следствием нарушения процесса созревания может быть наличие анеуплоидий в ядрах сперматозоидов, а также фрагментация ДНК сперматозоидов [6-7]. Фрагментация ДНК сперматозоидов — относительно недавно открытая предположительная причина мужского бесплодия, которая интенсивно исследуется в последнее десятилетие [8, 9]. В то же время известны противоречивые данные о возможном влиянии фрагментации ДНК сперматозоидов на ранние этапы эмбрионального развития, процесс бластуляции, на повышенный риск замирания беременности на раннем сроке и частоту спонтанных абортов [10, 11]. Фрагментация ДНК представляет собой двухцепочечные и одноцепочечные разрывы молекулы ДНК. Причинами разрывов ДНК считают процессы изменения структуры хроматина в ходе сперматогенеза и апоптоз [12-14].
Разрывы ДНК, выявляемые в эякуляторных сперматозоидах, могут являться следствием дефекта созревания в ходе сперматогенеза (репарации и ремоделинга). С другой стороны, не исключено, что такие дефекты могут служить факторами запуска апоптоза [15]. В среднем около 20% эякуляторных сперматозоидов мужчин с различными параметрами спермограммы выявляются как апоптотические. Установлено, что фрагментация ДНК, как следствие апоптоза, значительно ниже в группе мужчин с нормозооспермией в сравнении с группами мужчин с нарушениями параметров классической спермограммы [16]. Предполагается, что апоптоз служит конечным результатом различных патологических состояний и системой деградации, контролирующей сперматогенез [17]. Аномалии хроматина сперматозоидов часто ассоциированы с низкими показателями спермограммы, однако многие исследователи констатируют, что параметры фрагментации не имеют четкой корреляции с параметрами спермы, рекомендованными к исследованию ВОЗ (концентрацией, подвижностью, морфологией) [18-21]. В то же время в ряде исследований найдена отрицательная корреляция фрагментации ДНК с характеристиками спермограммы: концентрацией, подвижностью и процентом морфологически аномальных сперматозоидов [22, 23]. Спорным также остается вопрос о зависимости степени фрагментации ДНК от возраста пациента [24].
Цель. Целью данной работы было исследовать содержание сперматозоидов, несущих фрагментированную ДНК, у мужчин с высоким уровнем незрелых сперматозоидов в эякуляте, а также оценить степень бластуляции и частоту наступления беременности после переноса эмбрионов, полученных от таких пациентов, в ходе программы ЭКО.
Материалы и методы
В ходе данной работы были сформированы 2 экспериментальные группы. Группа 1 состояла из 132 пациентов, для которых была исследована зависимость между содержанием сперматозоидов с фрагментированной ДНК и частотой бластуляции эмбрионов в программе ЭКО. Средний возраст пациентов был 36,5±4,3 лет. В группу 2 были включены 120 мужчин, для которых была исследована корреляция между содержанием незрелых сперматозоидов и сперматозоидов, несущих поврежденную ДНК. Средний возраст пациентов был 39,5±6,2 лет. Отдельным этапом работы стало проведение исследования частоты наступления клинической беременности после переноса эмбрионов, полученных в программах ЭКО от 150 пациентов с разной степенью фрагментации ДНК сперматозоидов (группа 3).
Таблица 1. Частота формирования бластоцист (ЧФБ) для мужчин с разной
степенью фрагментации ДНК сперматозоидов (р<0,05).
Таблица 2. Содержание анеуплоидных спермиев и сперматозоидов, несущих
фрагментированную ДНК при нормальном и высоком содержании незрелых
сперматозоидов в эякуляте.
Таблица 3. Корреляция между параметрами спермограммы и степенью
фрагментации ДНК сперматозоидов
Отдельным этапом работы стало проведение исследования частоты наступления клинической беременности после переноса эмбрионов, полученных в программах ЭКО от 150 пациентов с разной степенью фрагментации ДНК сперматозоидов: 92 пациента со степенью фрагментации ДНК менее 20,0 %; 58 пациентов со степенью фрагментации ДНК более 20,0 %. Для данной группы пациентов частота наступления клинической беременности была практически в 1,6 раз больше для пациентов, у которых фрагментация ДНК сперматозоидов не превышала 20,0 % (р<0,05). Разница между частотой замирания беременности у пациентов с высокой степенью фрагментации ДНК сперматозоидов и уровнем фрагментации ДНК в пределах нормы статистически не значима. Данные представлены в таблице 4.
Таблица 4. Частота наступления беременности для пациентов с разной
степенью фрагментации ДНК спермы.
С целью исследования корреляции между уровнем фрагментации ДНК с показателями спермограммы в ходе подготовки к программе ЭКО/ИКСИ было обследовано 80 мужчин. Из них: 35 пациентов с астенозооспермией, 24 пациента с олигозооспермией и 21 пациент с тератозооспермией. Средний возраст пациентов был 39,5±4,3 лет. Группу контроля составили 20 пациентов с заключением спермограммы «нормозооспермия». С целью проведения анализа фрагментации ДНК сперматозоидов был использован метод SCD (sperm chromatin dispersion) (HaloSperm, Halotech, Испания). Метод основан на дисперсии хроматина вокруг ядра, за счет чего можно различить сперматозоиды с различной степенью фрагментации ДНК. Анализ был проведен с помощью флуоресцентного микроскопа Nikon Eclipse 80i. Результат был задокументирован с помощью цитогенетической программы Lucia FISH (LIM, Чехия). Содержание сперматозоидов в эякуляте, содержащих фрагментированную ДНК, в норме не должно было превышать 20,0 % [16].
Исследование степени зрелости сперматозоида основано на селекции сперматозоидов по степени связывания с гиалуроновой кислотой (hyaluron binding assay, HBA-тест). Только полностью зрелый сперматозоид с интактной ДНК имеет на головке специальные рецепторы и способен эффективно связываться с гиалуронатом. Для определения содержания зрелых спермиев в эякуляте были использованы наборы компании Biocoat Incorporation (США). В норме содержание незрелых сперматозоидов в эякуляте не должно было превышать 20,0 % [17].
В ходе программы ЭКО для КСО использовали протокол с а-ГнРГ. КСО занимала по времени не менее десяти дней. На момент трансвагинальной пункции размер фолликулов в среднем достигал 18 мм. Для поддержки лютеиновой фазы у пациенток применяли препараты прогестеронового ряда. Полученные после трансвагинальной пункции ооциты и зиготы в течение двух дней культивировались в средах Universal IVF Medium (Medicult). Эмбрионы, начиная с третьего дня развития и до стадии бластоцисты, культивировались в среде BlastAssist (Medicult). Культивирование эмбрионов проходило при температуре 36,8ºС – 37,1ºС; при содержании СО2 5,5 – 6,0 %. Перенос эмбрионов был проведен на пятые сутки развития эмбрионов в среде UTM (Medicult).
Полученные данные статистически обработаны с помощью t-критерия Стьюдента, а также путем определения коэффициента корреляции Пирсона [25]. Результаты При исследовании зависимости частоты формирования бластоцист (ЧФБ) от содержания сперматозоидов с поврежденной ДНК значительное снижение степени бластуляции выявлено при фрагментации ДНК более 40,0% (р<0,05). Результаты данного анализа приведены в таблице 1.
Корреляция между результатами HBA-теста и анализа фрагментации ДНК сперматозоидов была установлена в 82,5 % случаев (р<0,05). Результаты по исследованию степени зрелости сперматозоидов, содержанию сперматозоидов с анеуплоидиями и фрагментированной ДНК для 120 пациентов приведены в таблице 2.
При исследовании зависимости параметров спермограммы от уровня фрагментации ДНК спермы среди пациентов, для которых было выявлено высокое содержание сперматозоидов с фрагментированной ДНК, 27 пациентов имели заключение спермограммы «астенозооспермия» (77,1 % случаев астенозооспермии), 16 пациентов – с олигозооспермией (66,7 % случаев олигозооспермии), 10 пациентов – с тератозооспермией (47,6 % мужчин с тератозооспермией). В контрольной группе высокое содержание спермиев с фрагментированной ДНК было выявлено у 2 пациентов (10,0 % пациентов с нормозооспермией). Не выявлено значительных отличий по содержанию сперматозоидов, несущих фрагментированную ДНК, для пациентов с астено-, олиго- и тератозооспермией. Однако, содержание сперматозоидов с поврежденной ДНК значительно (р<0,05) выше у пациентов с низкими показателями спермограммы, в сравнении с пациентами с нормозооспермией. Результаты по исследованию корреляции между параметрами спермограммы и степенью фрагментации ДНК сперматозоидов приведены в таблице 3.
Отдельным этапом работы стало проведение исследования частоты наступления клинической беременности после переноса эмбрионов, полученных в программах ЭКО от 150 пациентов с разной степенью фрагментации ДНК сперматозоидов: 92 пациента со степенью фрагментации ДНК менее 20,0 %; 58 пациентов со степенью фрагментации ДНК более 20,0 %. Для данной группы пациентов частота наступления клинической беременности была практически в 1,6 раз больше для пациентов, у которых фрагментация ДНК сперматозоидов не превышала 20,0 % (р<0,05). Разница между частотой замирания беременности у пациентов с высокой степенью фрагментации ДНК сперматозоидов и уровнем фрагментации ДНК в пределах нормы статистически не значима. Данные представлены в таблице 4.
С целью анализа зависимости частоты наступления беременности от содержания незрелых форм сперматозоидов в эякуляте (от результатов НВА-теста) была сформирована группа из 91 пациента: 44 пациента с содержанием незрелых сперматозоидов менее 20,0 %, 47 пациентов с содержанием незрелых сперматозоидов более 20,0 %. В результате проведения программы ЭКО для указанной группы пациентов не было выявлено достоверной разницы между частотой наступления беременности для пациентов с содержанием незрелых форм сперматозоидов в пределах или выше нормы.
Выводы
Корреляция между результатами HBA-теста и анализа фрагментации ДНК сперматозоидов была установлена в 82,5 % случаев, что подтверждает возможность селективного метода, основанного на связывании гиалуроновой кислоты для выявления сперматозоидов, несущих неповрежденную ДНК (р<0,05). Зависимость степени бластуляции эмбрионов в программах ЭКО от степени фрагментации ДНК сперматозоидов выявлена в случае значения фрагментации ДНК 40,0 % и выше (р<0,05). Частота наступления клинической беременности значительно выше для пациентов, у которых фрагментация ДНК сперматозоидов не превышает 20,0 % (р<0,05). Разница между частотой замирания беременности у пациентов с высокой степенью фрагментации ДНК сперматозоидов и уровнем фрагментации ДНК в пределах нормы статистически не значима. Не выявлено значительных отличий по содержанию сперматозоидов, несущих фрагментированную ДНК, для пациентов с астено-, олиго- и тератозооспермией. Однако, содержание спермиев с поврежденной ДНК значительно (р<0,05) выше у пациентов с показателями спермограммы, отличными от нормы, в сравнении с пациентами с нормозооспермией. Не выявлено достоверной разницы между частотой наступления беременности для пациентов с содержанием незрелых форм сперматозоидов в пределах или выше нормы. Определение фрагментации ДНК и степени зрелости сперматозоидов могут быть рассмотрены как необходимые этапы диагностики в рамках подготовки пациентов к программе ЭКО. Значения фрагментации ДНК, а также оценка степени зрелости сперматозоидов имею прогностическую значимость качества эмбрионов, получаемы при применении методов лечения ВРТ.
Источник: www.uarm.org.ua Влияние фрагментации ДНК и нарушения процесса созревания сперматозоидов на степень бластуляции в программе ЭКО Авторы: А.М. Феськов1, И.А. Феськова1, Е.С. Жилкова1, Е.В. Сомова1, А .Н. Зозулина1 1Клиника профессора Феськова A.M., «Центр Репродукции Человека»
Список литературы
1. Воробьева О.А., Воскресенская А.В., Одинцов А.А., Филатов М.В. / Мужское бесплодие и нарушение структурной организации хроматина сперматозоидов. Существует ли связь? // Проблемы репродукции. – 2005. -№ 6. – с. 56-62.
2. Курило Л.Ф., Шилейко Л.В., Сорокина Т.М., Гришина Е.М. / Структура наследственных нарушений репродуктивной системы. // Вест РАМН.- 2000.- № 5. – c. 32-36
3. Agarwal A., Said T.M. / Role of sperm chromatin abnormalities and DNA damage in male infertility. // Hum Reprod. – 2003.- Vol. 19. — № 4. – P. 331-345.
4. Benchaib M., Braun V., Lornage J. et al. / Sperm DNA fragmentation decreases the pregnancy rate in an assisted reproductive technique // Hum. Reprod. — 2003. — Vol. 18, № 5. — Р. 1023-1028.
5. Brugnon F., Van Assche E., Verheyen G. et al. / Study of two markers of apoptosis and meiotic segregation in ejaculated sperm of chromosomal translocation carrier patients. // Hum Reprod. – 2006. –Vol. 21, № 3. – P. 683-685.
6. Calle J.F., Muller A., Walschaerts M. el al. / Sperm deoxyribonucleic acid fragmentation as assessed by the sperm chromatin dispersion test in assisted reproductive technology programs: results of a large prospective multicenter study // Fertility and Sterility. — 2008. – Vol. 19, № 6. – P. 671-682.
7. Cayli S., Sakkas D., Vigue L., Demir R., Huszar G. Cellular maturity and apoptosis in human sperm: creatin kinase, caspase-3 and Bcl_XL levels in mature and diminished maturiry sperm // Mol. Hum. Reprod. – 2004. -Vol. 10. — № 5.- P. 365-372.
8. Dohle G.R., Diemer T., Giwercm A., Jungwirth A., Kopa Z., Krausz C. Мужское бесплодие (научное редактирование: Акопян А.С.). – Европейская ассоциация урологов. – 2010. – 67 с.
9. Findikli N., Kahraman S., Kumtepe Y. /Assessment of DNA fragmentation and aneuploidy on poor quality human embryos // Reprod Biomed Online. — 2004. – Vol. 8.- № 2.- P. 196-206.
10. Henkel R., Kierspel E., Hajimohammad M. et al. / DNA fragmentation of spermatozoa and assisted reproduction technology // Reprod Biomed Online. – 2003.- № 7. – Р. 477-484.
11. Hong Ye, Guo-ning Huang , Yang Gao, De Yi Liu. / Relationship between human sperm-hyaluronan binding assay and fertilization rate in conventional in vitro fertilization // Hum. Reprod. – 2006. – Vol. 21. — №6. – P. 1545-1550.
12. Oehninger S., Chaturvedi S., Toner J. et al. / Semen quality is there a paternal effect on pregnancy outcome in in-vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection? // Hum Reprod. – 1998. – № 13. – P. 2161-2164.
13. Pandiyan N., Jequier A. / Meiotic structural chromosomal abnormalities of 1210 infertile males // Hum Reprod. – 1996. – Vol. 11. — № 12. – P. 1321-1326.
14. Sarah E. D., Sean P.F., Colin D. M. / Detection of chromosomes and estimation of aneuploidy in human spermatozoa using in-situ hybridization // Molecular Human Reproduction.-1997.-Vol. 3.-№ 7.-P. 585-598.
15. Schlegel P.N., Paduch D.A. / Yet another test of sperm chromatin structure // Fertil Steril.- 2005. – Vol. 84.- № 4. – P. 854-859.
16. Seli E., Sakkas D. / Spermatozoal nuclear determinants of reproductive outcome: implications for ART // Hum Reprod Update. — 2005. – V. 11, № 4. – P. 337-349.
17. Tesarik J., Mendoza C., Greco E. / Paternal effects acting during the first cell cycle of human preimplantation development after ICSI // Hum Reprod. – 2002. — № 17. – P. 184-189.
18. Mehdi Benchaib, ValeÂrie Braun, Jacqueline Lornage, Samia Hadj et al. / Sperm DNA fragmentation decreases the pregnancy rate in an assisted reproductive technique // Hum Reprod. — 2003. — V.18. — №.5. — Р. 1023-1028.
19. M. Muratori, S. Marchiani, L. Tamburrino, V. Tocci, P. Failli, G. Forti and E. Baldi. / Nuclear staining identifies two populations of human spermwith different DNA fragmentation extent and relationshipwith semen parameters // Hum Reprod. – 2008. —
V. 23. — №.5. — Р. 1035–1043.
20. Luke Simon, Gunnar Brunborg, Michael Stevenson,Deborah Lutton et al. / Clinical significance of sperm DNA damage in assisted reproduction outcome // Hum Reprod.
— 2010. — V.25. — №.7. — Р. 1594–1608.
21. B.E. Speyer, A.R. Pizzey, M. Ranieri, R. Joshi, J.D.A. Delhanty and P. Serhal. / Fall in implantation rates following ICSI with sperm with high DNA fragmentation // Hum Reprod. – 2012. — V.25. — №.7. — Р. 1609–1618.
22. F. Bronet, E. Martıґnez, M. Gaytaґn, A. Lin˜aґn, D. Cernuda, M. Ariza, M. Nogales et al. / Sperm DNA fragmentation index does not correlate with the sperm or embryo aneuploidy rate in recurrent miscarriage or implantation failure patients // Hum Reprod. – 2012. — V.27. — №.7. — Р. 1922–1929.
23. A.Borini, N.Tarozzi, D.Bizzaro, M.A.Bonu, L.Fava, C.Flamigni and G.Coticchio. / Sperm DNA fragmentation: paternal effect on early post-implantation embryo development in ART // Hum Reprod. – 2006. — V. 21. — №.11. — Р. 2876–2881.
24. K. Oleszczuk, A. Giwercman, M. Bungum. / Intra-individual variation of the sperm chromatin structure assay DNA fragmentation index in men from infertile couples // Hum Reprod. – 2011. — V.26. — №.12. — Р. 3244–3248.
25. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика, 1999. – 460 с.
