Целью нашей работы явилась оценка возможности использования определения активности теломеразы (АТ) в клеточном материале мочи для разработки неинвазивного метода диагностики рака мочевого пузыря (РМП). Данное исследование проводилось в урологической клинике Первого МГМУ им. И.М.Сеченова и в лаборатории МНИИМЭ, где было обследовано по 32 образца клеточного материала мочи в до- и послеоперационном периоде и 32 образца опухолевой ткани у пациентов с РМП. Все образцы опухолевой ткани были подвергнуты гистологическому исследованию, диагноз рака подтвержден во всех случаях. Группу контроля составили 10 образцов клеточного материала мочи и 10 образцов ткани мочевого пузыря у больных с гистологически верифицированным хроническим циститом. Клеточный материал осадка мочи получали путем центрифугирования мочи с промыванием осадка в растворе PBS и последующем замораживании сухого осадка мочи в жидком азоте. В качестве образцов опухолевой ткани использовали операционный материал после трансуретральной резекции стенки мочевого пузыря, открытой резекции стенки мочевого пузыря, цистэктомии. Определение АТ в образцах проводили с помощью следующих методов: модифицированный TRAP-метод; ОТ-ПЦР; ПЦР; электрофорез. Кроме того, образцы были проанализированы на предмет наличия в них ингибиторов АТ. При подозрении на наличие ингибиторов АТ проводился повторный анализ с разведением лизата для выявления истинных значений АТ. Чувствительность метода составила 96,8%, специфичность – 100%.
Рак мочевого пузыря (РМП) – одна из самых распространенных опухолей мочевыводящих путей. В 2006 г. в Европе было диагностировано 104 400 случаев РМП, из которых 82 800 у мужчин и 21 600 у женщин. Это составляет 6,6% от всех злокачественных опухолей у мужчин и 2,1% у женщин, при этом отношение между полами составило 3,8:1. У мужчин РМП занимает 4-е место среди злокачественных опухолей. В структуре общей смертности от злокачественных новообразований на долю РМП приходится 3,1% у мужчин и 1,8% у женщин[1]. Диагностика рака мочевого пузыря и оценка степени распространенности опухолевого процесса основывается на результатах клинических, лабораторных, ультразвуковых, эндоскопических, рентгенологических, компьютерных, магниторезонансных и морфологических методах исследования. Выше описанные методики являются инвазивными, трудоемкими и дорогостоящими. В связи с этим большой интерес представляет внедрение неинвазивных методов диагностики, в частности исследование онкомаркеров РМП в клеточном материале мочи. В настоящее время активно обсуждается возможность использования фермента теломеразы в качестве универсального онкомаркера. Теломераза – фермент, синтезирующий теломерные повторы ДНК(ТТАGGG у млекопитающих) на 3′-концах хромосом. Ключевая роль данного фермента в поддержании процесса неограниченного деления клетки обусловливает универсальность и высокую чувствительность методов его определения в ткани для диагностики злокачественного поражения.
В большинстве соматических клеток активность теломеразы (AT) отсутствует, что приводит к тому, что после определенного числа клеточных делений (примерно 80-100) длина концевых теломерных последовательностей ДНК уменьшается до критического уровня и клетка подвергается апоптозу — запрограммированной клеточной гибели. Фермент теломераза, восстанавливая утраченные теломеры на концах хромосом, обуславливает ее иммортальность, т.е. способность к неограниченному делению. Многие авторы считают, что информация об активности теломеразы может иметь большое значение в диагностике рака [2, 3, 4]. Возможность использования АT в диагностических тестах довольно велика, так как позитивный результат может быть получен при наличии в образце всего лишь нескольких опухолевых клеток, при этом важно, что для диагностики могут оказаться пригодны образцы, полученные неинвазивными и минимально инвазивными способами. Например, АT в случае карциномы мочевого пузыря была обнаружена в эксфолиативных раковых клетках мочи и промывной жидкости [5, 6]. В зарубежной литературе чувствительность определения АТ в клеточном материале мочи у больных с РМП составляла от 70 – 94%, специфичность метода от 88 – 99% [7]. Предполагают, что кроме диагностических тестов, АT может найти применение и в прогнозировании исхода болезни. Как показывают результаты экспериментов, для некоторых видов опухолей существует корреляция между АT и определенными клинико-патологическими показателями. Диагностический и прогностический потенциал теломеразы требует дальнейшего исследования с привлечением большего числа больных и с более длительными периодами наблюдения. Для этих целей также необходимо усовершенствование методов количественного определения АT.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ
Целью нашего исследования стала оценка возможности использования определения активности теломеразы в клеточном материале мочи для разработки неинвазивного метода диагностики рака мочевого пузыря (РМП).
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи: разработка метода получения клеточного материала мочи для сохранения его нативности и возможности определения в нем активности теломеразы (АТ); исследование АТ в клеточном материале осадка мочи у пациентов с раком мочевого пузыря в до — и послеоперационном периоде; исследование АТ в опухолевой ткани у пациентов с раком мочевого пузыря; изучение клинической ценности определения АТ в клеточном материале осадка мочи у пациентов с раком мочевого пузыря.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Нами было обследовано 42 пациента, среди которых было 35(83,3%) мужчин и 7(16,7%) женщин. Возраст мужчин 64(34-84) года, возраст женщин – 59(39-81) лет. Мы распределили пациентов на 2 группы в зависимости от гистологического исследования. Первая группа из 32 пациентов с гистологически верифицированным РМП включала в себя 27 мужчин и 5 женщин, средний возраст которых составил 64,5 лет. Вторая группа из 10 пациентов с гистологически верифицированным циститом включала в себя 8 мужчин и 2 женщины, средний возраст которых составил 62 года. Клеточный материал мочи получали путем центрифугирования мочи с промыванием осадка в растворе PBS и последующем замораживании сухого осадка мочи в жидком азоте. В качестве образцов опухолевой ткани использовался операционный материал после трансуретральной резекции стенки мочевого пузыря, открытой резекции стенки мочевого пузыря, цистэктомии. Гистологическое исследование ткани мочевого пузыря проводилось в морфологической лаборатории Первого МГМУ им. И.М. Сеченова. Определение АТ в клеточном материале мочи и ткани мочевого пузыря проводилось в лаборатории молекулярных основ онкогенеза Курчатовского НБИКС-центра. До начала обработки и молекулярно-биологического исследования образцы хранили при температуре -700С. Применялись следующие методы: ОТ-ПЦР; ПЦР; модифицированный TRAP-метод; электрофорез. Также в данных образцах был проанализирован уровень активности теломеразы (АТ) методам TRAP-анализа и относительный уровень экспрессии гена hTERT методом ОТ-ПЦР. Экспрессию гена hTERT нормализвали относительно уровня экспрессии гена «домашнего хозяйства» (β-актин). Кроме того образцы были проанализированы на наличие в них ингибиторов АТ. В случае подозрения на наличие ингибиторов АТ в образцах проводился повторный анализ с использованием разведений исходного образца с целью выявления истинных значений АТ.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Среди пациентов с гистологически верифицированным РМП в клеточных материалах мочи в предоперационном периоде АТ была выявлена у 31 из 32 (96,8%) пациентов, а в опухолевой ткани — у 32 из 32 (100%) пациентов. Причём средний уровень АТ в образцах ткани был в 2,2 раза выше среднего уровня АТ клеточном материале мочи. Также нами проанализированы 32 образца клеточного материала мочи в послеоперационном периоде у пациентов с РМП, АТ в данных образцах не было зарегистрировано. Отмечено статистически значимое преобладание больных РМП при наличии в моче АТ (р=0,001). У 10 пациентов с гистологически верифицированным циститом в клеточных материалах мочи и ткани АТ не выявлено. В таблице №1 отражена зависимость уровня АТ в клеточном материале мочи и ткани от стадии РМП.
В случае присутствия в исследуемом экстракте АТ продукты ее деятельности после амплификации, разделения методом электрофореза и окраски выглядят как горизонтальные полоски, располагающиеся на равном расстоянии друг от друга. На рисунке №1 видно, что в клеточном материале мочи и опухолевой ткани больного Ш. АТ высокая. Линия К+ соответствует положительному контролю (проба содержит экстракт опухолевых клеток), линия К- соответствует отрицательному контролю (проба не содержит экстракта опухолевых клеток). АТ в контрольном образце условно принималась за 100%.
На рисунке 2 наглядно видно отсутствие горизонтальных полос в исследуемых образцах клеточного материала мочи и ткани мочевого пузыря, в то время как в контрольном образце они присутствуют. Следовательно, в данном образце клеточного материала мочи и ткани мочевого пузыря АТ отсутствует.
Проведенное нами исследование показало, что наличие теломеразы, по видимому, напрямую связано с процессом злокачественной трансформации при РМП. АТ была обнаружена в большинстве образцов клеточного материала мочи и опухолевой ткани, полученного от пациентов с РМП. Отсутствие АТ в одном образце от пациента с исследуемой онкопатологией, вероятнее всего, связано с инактивацией теломеразы в процессе проведения забора образца. Следует отметить, что диагностический и прогностический потенциал теломеразы достаточно велик, но требует дальнейшего исследования с привлечением большего числа больных, а также увеличения периода наблюдения за ними.
ВЫВОДЫ
Согласно полученным данным определение АТ в клеточном осадке мочи пациентов может стать основой для разработки неинвазивого метода диагностики РМП. Наиболее высокий уровень АТ наблюдался на стадиях 1 и 2а, когда наблюдается наиболее активный рост опухоли. Наиболее низкий уровень АТ отмечался на стадии 4, что, возможно связано со снижением уровня пролиферации клеток опухоли на поздних стадиях её развития. Таким образом, наличие АТ в клеточном осадке мочи может быть важным маркёром РМП на ранних стадиях РМП.
Авторы: ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ТЕЛОМЕРАЗЫ В КЛЕТОЧНОМ МАТЕРИАЛЕ МОЧИ ДЛЯ НЕИНВАЗИВНОГО МЕТОДА ДИАГНОСТИКИ РАКА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ / П.В. Глыбочко1, Ю.Г.Аляев1, А.З. Винаров1, К.А.Поляковский1, Н.В.Потолдыкова1, А.И.Глухов2, Я.Е.Григорьева2, 1Первый МГМУ им. И.М. Сеченова, кафедра урологии лечебного факультета, НИИ Уронефрологии и Репродуктивного Здоровья человека, 2 Первый МГМУ им. И.М.Сеченова, кафедра биохимии
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ferlay J, Autier P, Boniol M, Colombet M, Boyle P. Estimates of the cancer incidence and mortality in Europe in 2006. Ann Oncol 2007;18(3):581-92.
2. Drummond M.W., Hoare S.F., Monaghan A., Graham S.M., Alcorn M.J., Keith W.N., Holyoake T.L., Dysregulated expression of the major telomerase components in leukaemic stem cells // Leukemia 19(3). 2005. 381–389.
3. Fletcher T.M. Telomerase: a potential therapeutic target for cancer // Expert Opin. Ther. Targets. 9(3). 2005. 457–469.
4. Kleideiter E., Bangerter U., Schwab M., Boukamp P., Koscielniak E., Klotz U., Greil J., Telomeres and telomerase in paediatric patients with T–cell acute lymphoblastic leukaemia (T–ALL) // Leukemia. 19(2). 2005. 296–298
5. Kinoshita H., Ogawa O., Kakehi Y., Mishina M., Mitsumori K., Itoh N., Yamada H., Terachi T., Yoshida O. Detection of telomerase activity in exfoliated cells in urine from patients with bladder cancer // Journal of the National Cancer Institute. 1997. 89. 724–730.
6. Gelmini S., Crisci A., Salvadori B., Pazzagli M., Selli C., Orlando C. Comparison of telomerase activity in bladder carcinoma and exfoliated cells collected in urine and bladder washings, using a quantitative assay // Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research. 2000. Jul. 6(7). 2771–2776.
7. M.A. Sanchini, R.Gunelli, O.Nanni et al. Relevance of urine telomerase in the diagnosis of bladder cancer. J.A.M.A. 2005; 294 (16): 2052-2056.
